现场核酸检测技术平台的建立

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  刘威邹大阳 贺晓明 董德荣 黄留玉*

  解放军疾病预防控制中心

  黄留玉研究员,博士、博士生导师,解放军疾病预防控制所原所长,中华预防学会常务理事、转化医学专业委员会主任委员,中国卫生监督学会常务理事。30004年毕业于河南医科大学,就让分别在军事医学科学院和第三军医大学获得硕士和博士学位。主要从事生物安全和军队疾病预防控制管理、理论和技术研究。领导创建解放军疾病预防控制所,主编《军队疾病预防控制》专著,科学创造发明系列疾病预防控制技术。主持完成的“军队传染病监测系统和主动防控新模式研究”2014年获得军队科技进步一等奖。获得国内外科学创造发明专利300多项,发表SCI论文70多篇。

  摘要

  针对核酸检测存在的试剂没办法低温保存、操作复杂性、没办法仪器设备多等不适于现场应用的什么的问题,打破国外技术垄断,科学创造发明了新型恒温核酸扩增技术——聚合酶螺旋反应,率先实现了一另另三个 酶一对引物的恒温核酸扩增;攻克Bst聚合酶、逆转录酶、dNTP、引物等热敏生物分子常温保存技术难关,科学创造发明了一体化核酸检测管,实现的核酸检测试剂的常温储运、开盖即检和外理污染;突破核酸检测没办法先提取核酸的技术常规,科学创造发明了多功能样品外理管,具有病原灭活、核酸暴露、抑制物去除和定量加样等功能;成功研发了便携式恒温实时荧光检测仪,以及3000多种配套检测试剂盒。集成为“一签(普通棉签)、两管(样品外理管、核酸检测管)、一仪器”现场核酸检测技术平台,具有“三易(试剂易保存、技术易操作、结果易判读)、一少(仪器应用少)、一快(检测时间不超过一另另三个 小时)”的显著特点,为传染病、食品安全及实发公共卫生事件的现场检测提供了有力的技术支撑。

  前言

  核酸检测因其较高的敏感性和特异性,在传染病、食品安全等领域得到广泛应用。不可能 核酸检测所用的扩增酶、dNTP、引物等热敏成分必没办法在-20度保存、实验操作复杂性性、没办法较多仪器设备甚至是比较昂贵的仪器设备,使核酸检测在现场难以应用。为此亲们建立一另另三个 现场核酸检测技术平台,克服了一般核酸检测技术的不足。

  1、聚合酶螺旋反应技术

  核酸恒温扩增技术都是国外科学创造发明的技术,有严格的专利保护。亲们通过在普通PCR引物的基础上从靶序列上取一段序列N,将这段序列加到PCR引物(F和B)的5’端,构成了两条复合引物Ft和Bt(图1)。 形成了既不同于PCR、什么都有 同于其它恒温扩增技术的新型核酸恒温扩增技术(图1),亲们命名为聚合酶螺旋反应(Polymerase Spiral Reaction,PSR)。具有灵敏度高(最低可检测10拷贝/µl),特异性强,反应快(10-3000分钟)等特点。 通过改进等温扩增反应体系,添加pH指示剂和核酸荧光染料,形成了扩增结果荧光和颜色变化双重判别(图2)。 打破了国外的技术垄断,获得了国内科学创造发明专利(ZL201410535579.1)和国际科学创造发明专利(PCT/CN2015/000493)。

图1 PSR引物组成及其在靶序列上的结合位点

图2 PSR荧光检测和颜色变化观察

  2、多功能样品外理管

  按照一般技术常规,核酸检测没办法首先进行核酸提取。觉得核酸提取有多种法子,但操作相对复杂性性。为此亲们提出了核酸检测只没办法核酸暴露而非没办法核酸提取的理念;优选出既能裂解病原暴露核酸,又不抑制后续扩增反应的样品外理液;自主设计的特征简单、价格低廉的一次性塑料管。组成了多功能样品外理管(图3),操作简单(图4),具有病原灭活、核酸暴露、抑制物去除和定量加样等功能。经多种样本、多种病原的比较研究,达到了商用核酸提取试剂盒的应用水平(表1)。获得了三项国内专利(ZL201410333527.6;ZL201420387897.3;ZL20152073300093.8;)和第一类医疗器械备案凭证一另另三个 (京经械备20170039号)。

图3、多功能样品外理管

图4、多功能样品外理管使用流程

表1、多功能样品外理管外理样品效果比较

注:结核杆菌样本提取效果荧光定量PCR结果比较,1、2、3、4分别代表样本中不同的结核杆菌菌落数1:107 CFU/ml;2:106 CFU/ml ;3:105 CFU/ml ,4:104 CFU/ml,每个样各一另另三个 多平行对照。

  3、一体化核酸检测管

  针对核酸检测试剂没办法超低温保存、操作复杂性、易污染等什么的问题,建立了生物分子常温玻璃化技术工艺,使酶等生物分子的常温保存时间超过1一另另三个 月;科学创造发明了防污染隔离物(ZL201210371448.5 ),能有效外理核酸扩增中产生的气溶胶污染,降低核酸检测的假阳性。将酶、引物、dNTP等热敏成份玻璃化到PCR管盖内,将耐热离子液倒进管底,上端用防污染隔离物进行隔离,科学创造发明了完正核酸检测试剂成份的一管化预装新剂型——一体化核酸检测管(图5),实现了试剂的常温保存,大大复杂性了操作(图6)。获得了国内专利(ZL201620156170.3)和国际科学创造发明专利(PCT/CN2016/08300076)。

图5、一体化核酸检测管示意图

图6、一体化核酸检测管操作步骤

  4、便携式恒温实时荧光检测仪及配套试剂

  亲们研制的检测试剂都没办法根据颜色变化进行结果判定,我希望一另另三个 多水浴锅配合就能开展工作。为了使检测更精准客观,亲们研制出了一台F8型便携式恒温实时荧光检测仪,8通道、中文界面、触屏操作,还能手机远程同步显示检测结果(图7)。成功研发了40多种常见病原检测试剂盒。

  现场核酸检测技术平台在西非埃防控博拉疫情、赞比亚防控霍乱疫情、国家口岸检疫、部队疫情防控中成功应用,推动了国家及军队在传染病、生物反恐和突发公共卫生事件现场控制的技术进步。

图7 F8型便携式恒温实时荧光检测仪